分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)—凝膠電泳、成像篇

上海颯凌電子 2020-5-15

瓊脂糖凝膠電泳原理

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳主要區(qū)別是:它兼有"分子篩"和"電泳"的雙重作用。

瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小。

DNA 在堿性條件下（緩沖液pH8.0）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同DNA   篇段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率也不同。核酸染料可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶。

哪些因素會(huì)影響DNA分子的遷移速率呢？

DNA 的分子大小

 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA篇段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA篇段大小介于兩者間所需膠濃度為0.8-1.0%。

DNA分子構(gòu)象

DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)，它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)很快，而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)慢。

 電源電壓

在低電壓時(shí)，線狀DNA篇段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA篇段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA篇段有效分離所加電壓不得超過(guò)5V/cm。

嵌入染料的存在

染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會(huì)使線狀DNA遷移率降低。

離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。

因此，在實(shí)際電泳過(guò)程中需要充分考慮以上幾種因素，選擇合適的電泳條件，從而達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

凝膠電泳過(guò)程中所用到的實(shí)驗(yàn)器具及試劑主要有：

水平電泳儀，恒溫水浴鍋/微波爐，移液器，緩沖液，瓊脂糖，核酸染料，DNA Ladders

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 安裝電泳槽，準(zhǔn)備制膠

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求及目的，選擇合適的制膠板及梳子。

2. 制備瓊脂糖凝膠

根據(jù)DNA的篇段大小，選擇瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中的比例。稱取瓊脂糖置于緩沖液中，選擇水浴鍋或者微波爐加熱至*溶解，并搖勻。

3. 灌膠

     將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。

4. 待瓊脂糖凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，拔出梳子。

5. 加樣

       將DNA樣品與加樣緩沖液按比例混勻后，用移液器加到樣品槽中。

6. 電泳

     安裝好電極導(dǎo)線，打開電源，調(diào)節(jié)電壓3-5V/cm，當(dāng)溴酚藍(lán)到距凝膠前沿1-2cm時(shí)，停止電泳。

7. 染色和觀察

       取出凝膠，放進(jìn)含有核酸染料的稀釋液中（按說(shuō)明書要求稀釋，或者在制膠過(guò)程中加到凝膠內(nèi)）染色，在紫外或者藍(lán)光燈下觀察。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意一下內(nèi)容：

（1）凝膠成像系統(tǒng)的選擇：成像產(chǎn)品主要可以分為藍(lán)光系統(tǒng)和紫外系統(tǒng)。

藍(lán)光切膠儀的光源為藍(lán)光，發(fā)射波長(zhǎng)為470nm，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及樣品的損害較小。適用于一些安全染料，如：SYBR Safe、SYBR Green I 等。

紫外光源適用于所有染料，254nm、365nm、312nm 三種不同的波長(zhǎng)可選擇。

（2）DNA Ladders 的選擇：所擴(kuò)增的片段應(yīng)在DNA Ladders的指示范圍內(nèi)，否則無(wú)法起到指示作用。